借助于噬菌体ELISA的DNA/RNA结合活性的分析方法

A.噬菌体的制备
1．挑取含有源自文库筛选的噬菌体克隆的单菌落。用灭菌牙签挑取单菌落接种于灭菌圆底培养板的微孔内，其中加有150ul含15ug/ml的四环素的2×TY培养基。用一个微孔培养展示野生型DNA/RNA结合区域的噬菌体，作为阳性对照。以250r/min的速度小心振荡微孔板，30℃培养16小时。
2．在合适的吊斗式离心机中3700g离心96孔培养板15分钟，以制备噬菌体上清液。将上清液转移到一个新的微孔板内，4℃保存。

B.噬菌体ELISA
1，将生物素联结的核酸靶标位点（通常是0～5pmol之间，稀释于50ul PBS缓冲液中）加入链亲和素包被的微孔板内。对于阳性对照，将适量的野生型结合位点加入一个微孔内。用一个只含PBS缓冲液的微孔作为阴性对照，以测定ELISA的本底。将微孔板于20℃放置15分钟。
2．每孔加入150gl含有4％（w/v）脱脂牛奶的PBS缓冲液作为封闭剂。将微孔板于20℃放置1小时。
3，将噬菌体上清液（得自步骤A2）1；10稀释于lml含有2％（w/v）脱脂牛奶、1％（体积分数）Tween-20及20ug/ml的超声破碎的鲑鱼精DNA的PBS缓冲液中。
4．将核酸包被的微孔中的封闭液弃去，加入50ul稀释过的噬茵体上清液。将微孔板于20℃放置l小时。
5．将结合液弃去，用200ul含1％（体积分数）Tween—20的PBS缓冲液洗涤7次，再用PBS缓冲液单独洗涤3次。
6．将HRP联结的抗M131gG抗体用含有2％（w/v）脱脂牛奶的PBS缓冲液作l：5000稀释，然后每孔加入50g1。20℃放置l小时。
7．将抗体结合液弃去，用200ul含0．05％（体积分数）Tween—20的PBS缓冲液洗涤3次，再用PBS缓冲液单独洗涤3次。
8．加入100ul HRP底物液，如上文所述的基于TMB的显色液，使ELISA显色。约5分钟后终止显色反应，如使用TMB，则加入100ul 1 mol/L的硫酸。立即用酶标仪测定ELISA数值。
9．要评估筛选出的结合区域的特异性序列的结合性，将它们的ELISA数值与阳性对照孔和阴性对照孔的数值进行比较。

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