筛选解离速率优化的scFv

[方法]
1．每个克隆用lml 2XTY／amp／S1u 30~C培养过夜，250r／min振荡。
2．取50u1过夜培养物，加入到含有5ml 2XTY／amp／0．1％glu的50ml试管内；并在30℃培养大约2小时，250r／Illin振荡，吸光度（A600）大约0．9。
3．每管加入2．5ul lmol／LIPTG诱导scFv表达（终浓度为500umol／L），并在30℃培养4h，250r／min振荡。在1个15ml Falcon试管内4000g离心15分钟，收集细胞。
4．准备外周质提取物。用200u1 PPB缓冲液重悬细菌沉淀，将沉淀悬液转移到1．5m1试管内，放于冰上20分钟；这会使细胞皱缩并提取部分scFv蛋白；加入低渗性MgCl2使外周质处于高渗状态促进肿胀。用微型离心机沉淀细胞，6000r／min 5分钟。弃去上清。细菌沉淀部分将用于渗透压休克的制备。
5．准备渗透压休克组分。用200u1 5mm01／L MgSO4重悬沉淀并在冰上孵育重悬沉淀物20分钟。用微型离心机全速（14000r／min）离Jc沉淀细胞5分钟。取1支新试管保存上清，即为渗透压休克组分。
6．用CentriSep柱将含有scFv的渗透压休克缓冲液换为Blacore运行缓冲液（HBS），操作按厂家所述进行。
7．根据厂家说明书装配Biacore仪。在Biacore仪流动池内，用EDC／NHS化学法将靶抗原固化在CM5传感芯片上，操作按厂家所述进行。
8．将步骤5所制备的scFv样品注入到流动池内，1分钟。而后，保持15u1／min的恒定流速，用HBS作为运行缓冲液，观察解离相2一10分钟。
9．再生芯片的表面，并进行下一个scFv分析。可以编写程序使此过程自动进行，使40～50个scFv的数值能自动进行过夜分析。使用Biacore厂家提供的软件，可对每个所分析的scFv自其感应图的解离部分测定出表观κoff值。
经过上述分析后，就能根据Aof／值高低将克隆依次排列。然后，纯化解离速率zui低的scFv并测定其Kd值。这种载体附加了C末端六组氨酸标签，因此，用固相金属亲和层析（IMAc）从外周质中纯化出scFv。而这对于那些在已含有六组氨酸标签的噬菌体展示载体中的克隆来说，却无必要。而后，用胶过滤方法去除凝集的和二聚化的scFv，用BIAcore仪进行SPR测定κon值和Aoff值，再以此计算出Kd值。

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