平衡法选择高亲和力噬菌体抗体

1．多样化的噬菌体抗体丈库中制备噬菌体抗体。
2．根据厂家说明，对抗原进行生物素化。
3．选择前，在1个1．5m1微量离心管中．用2％MPBS 1m1封闭150ul链霉亲和素磁珠，室温1小时。用磁性试管架将碰珠吸向一侧。弃去缓冲液。
4．用2％MPBS封闭3个1．5m1微量离心管，室温1小时；而后，弃去封闭缓冲液。以3个不同浓度将士物素化抗原（总共3管）与溶于2％MPDS（终浓度）的1m1噬茼体样品（大约1012c{u／m1）进行孵育，室温振荡l小时。对于*轮选择，抗原浓度应分别为Kd／l、Kd／10以及Kd／100；此处Kd＝针对抗原的野生型抗体亲和力。
5．每管加入50u1链霉亲和素化磁珠并在转台上孵育，室温15分钟。将试管放入磁架30秒。磁珠将移向磁体。
6．抽吸上清，让磁珠留在微量离心管一侧。是用200u1吸头套在巴氏吸管上，再接 到真空源上进行。用PBS／Tween洗涤磁珠7次（每次洗涤用lml），接着用MPBS洗涤2次，再用PBS洗涤1次。每隔一次洗涤就将磁珠转移到1个新的1．5m1试管中，以充分洗涤。
7．用100u1 100mmol／L HCl将噬菌体从磁珠上洗脱下来，室温10分钟。将试管放入磁架30秒，沉淀磁珠。移取含有洗脱的噬茼体上清，并用1m11inol／L Trls（pH 7．4） 中和。冰上保存洗脱液。
8．将0．75m1洗脱噬菌体加入到10ml对数生长的大肠杆菌TGl（A600约0．5） 中。4℃下储存剩余的洗脱噬菌体。
9．37℃下静置孵育洗脱物—大肠杆菌混合液，30分钟。
10．将1ul和10ul感染的TGl细胞在100mmTYE／amp／glu平板上铺板接种，滴定洗脱液（稀释比例分别为104和103）。
11．离心剩余的细菌培养液，2700g 10分钟。将沉淀重悬于250ul 2×TY中，并在2个150mmTYE／amp／R1u平板上铺板，37℃孵育过夜。
12．次晨，每个平板加入3m1 2×TY／amp／glu，再用弯曲玻璃棒自平板上刮取细菌。将1．4ml菌液与0．6m1 50％的甘油（无菌过滤）混合制备甘油储存料。-70℃下保存。分析产出滴定结果（步骤9）以确定哪个（从抗原农度＝Kd／1、Kd／l0以及Kd／100）确定出相应的噬菌体以用于下一轮选择的改良。过去，我们依据噬菌体EUSA测定的结合性克隆阳性率或依据BIAcore测定的活性噬菌体浓度，进行判断。不过根据经验，可以通过分析产出滴度作出选择： 当产出滴度比抗原浓度下降更明显时（即当比较来自Kd／l、Kd／10以及Kd／100的3个产出滴度时），一般是结合减少的结果，那么此浓度下的噬茵体不应用于后续的选择。而应当用较高抗原浓度的噬菌体替代。我们每轮把抗原浓度平均降低大约90％倍，而在亲和力成熟的zui后一轮常常使用飞摩尔的的抗原浓度。
13．从来自步骤ll的合适的甘油储存料中制备噬菌体抗体；从本实验方案步骤1重复进行。

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