噬菌体展示文库体外筛选的通用步骤

1．通过腹腔注射浓度为1．25％（w/v）的阿佛丁来麻醉小鼠。
2．打开胸腔并暴露心脏。
3．用10ml的DMEM或PBS来灌注小鼠。
4．连同一个或多个对照器官一起，取出要研究的器官和组织，并将其置于一个直径为30m的细胞培养皿中。
5．用无菌刀片将每个器官或组织都切碎。
6．将切碎的器官或组织放到2．2m1的无菌塑料管中，并加入1．8m1 0．5mg/m1的胶原酶。混匀并在37℃摇瓶孵育30分钟。在37℃培养时，持续摇动样品。
7．以1500r/min的速率短暂离心细胞悬液5分钟，并弃去上清。
8．将每份用胶原酶处理过的器官或组织放到70txm的尼龙细胞滤网上，并把悬液过滤到50m1锥形瓶中。加入10ml含1％BSA的DMEM到细胞滤网顶部，让细胞都过滤到50m1锥形瓶中，加两次。这使得细胞悬液的总量为20ml。在台式临床离心机中，以1500r/min离心5分钟沉淀细胞。丢弃上清，并用20m1含1％BSA的DMEM洗涤沉淀两次。
9．第6～8步也可用DAKO’s MediMachine制备来自器官或组织的单细胞悬液。将每份器官或组织分别放入50/1m的Medicon中，并置于MediMachine中打散2分钟。用1ml的LHer注射器抽出Medicon中的细胞悬液，并通过?0gm的Filcon把单细胞悬液过滤到14m1的锥形瓶中。将1m1含1％BSA的DMEM加到MediCOn的小室中，并重复打散和抽滤的步骤。将整个循环重复3次。在台式临床离心机中，细胞悬液以1500r/min离心5分钟。弃去上清，并保留细胞沉淀。
10．用1ml含1％BSA的DMEM重悬来自第8步或第9步的细胞，并在光学倒置显微镜下用Neubauer-ruled血球计数板来计数。
11．将每份器官或组织的细胞悬液都取出一部分，使得每个1．7ml塑料管中细胞总量约为1×107个。
12．将细胞在冰上放置5分钟。
13．把109～1010TU或pfu的噬菌体加到细胞中，并加入含1％BSA的DMEM使其总体积为0．5～1ml。根据需要可以采用体积更大的噬菌体。
14．将噬菌体和细胞一起在4℃孵育30分钟至过夜。低温会阻止对所有已结合的噬菌体的内吞作用。 当检测单克隆时，我们采用较短的时间，而当筛选不同的初的文库时，则采用较长的时间。
15．细胞悬液以5000r/min的速率短暂离心2～3分钟，并弃去上清。
16．用含1％BSA的DMEM重悬细胞，轻轻吹打。以5000r/min的速率短暂离心细胞2—3分钟，并弃去上清。再重复此操作3次，共洗涤4次。zui终，第5次用含1％BSA的DMEM重悬细胞沉淀，将其转入一个新的2．2m1无菌塑料管中。以5000r/min短暂离心细胞2～3分钟，并弃去上清。

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