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[方法]1．在0．5ml微量离心管中，配制两个50/z1PCR反应混合液（1个用于VH—VκscFv文库，另1个用于Vu—VλscFv文库），其中含有：●水，36．5//1●10XTag缓冲液，5．0ul●20XdNTP，2．5ul●正向引物，2．0ul●反向引物，2．0ul●scFv基因文库（约long），1．0ul2．在热循环仪格内加热反应管到94℃，5分钟。如果没有加热盖，则滴加1滴轻质矿物油覆盖反应液。3．加入1．0ul（5单位）TdQDNA聚合酶。4．以94℃1分钟...
[方法]1，配制两个100ulPCR反应混合液来消化scFV文库，其中1个用于VH-VκscFv文库，另1个用于VH-VλscFv文库，该混合液含有：●scFVDNA（1～4ug），50ul●水，33ul●10×NEB3缓冲液，10ul●乙酰BSA（100×），1．0ul●Nco工（10U/ul），3．0f11●NoJ工（10U/ul），3．0ul2．37℃孵育反应液过夜。要用37℃孵育箱或者有加热盖的加热装置，防止水分蒸发。或者，可以按PCR反应那样加一层矿物油（Sigma...
[方法]1．将电转化仪设置为200D（电阻）、25rtF（电容）和2．5kV。2．在冰上复溶电感受态细菌或使用新鲜制备的电感受态细胞。将电转化杯、杯固定夹、细胞和DNA均放于冰上。3．将80ng已纯化且无盐的DNA与50g1细菌混合。冰上孵育混合物1分钟。4．将混合物转移至0．2cm间距的电转化杯中，小心操作切勿在电极间留气泡。轻拍小杯，使所有液体均沉淀于瓶底。迅速转移以使小杯处于低温状态。5．将透明杯放入电转化仪内，确保小杯侧面干燥（以免电弧）。启动脉冲，立即加入1．0ml...
抗体文库储存料中制备噬菌体。在开始实验之前，先用滴定法（在TYE/amp/glu平板上系列稀释铺板）计算每毫升抗体文库储存料中细菌的数目。在600nm（A600）处的某个特定吸光值下，抗体文库中细菌数目较未感染细菌数目低一些。这或许是因为含有质粒的文库细菌体积更大，或者是存在死细菌。一旦滴度与A600确定关系，吸光值即可用于细菌数目的计算。对于噬菌体的制备（文库救援），来自文库储存料的起始接种量应比文库容量大5倍。接种到培养基后，细菌浓度的A600不应超过0．05。采用文库容...
1．在每毫升zui后的噬菌体悬液（例如来自实验方案13．11）中，加入0．45g氯化铯，充分混匀至溶解。2．用吊桶式转头（或与其相当的型号）离心溶液，15℃17h，噬菌体将浓缩在组分1和组分2中（。组分1的浓度较高，但组分2的体积较大。用巴氏滴管或塑料注射器吸取这些组分。如果是*次使用本实验方案，那么先收集所有条带并分别对其检测将是明智之举。3．将收获的溶液对PBS透析过夜。4．通过感染大肠杆菌DH5cF，或TGl滴定各个不同组分中噬菌体，并保存滴度zui高的组分。通常，噬菌...
从噬菌体抗体文库中分离抗原特异性抗体，是通过让噬菌体进入到在抗原上进行的重复性选择循环来实现的。理想情况下，仅需l轮选择即可完成。但事实是，丝状噬菌体常常非特异性地结合到支持物表面，从而限制了每轮所能获得的富集水平。实际上，需要2～5轮的选择。现在已设计了许多各自不同的选择方法；其中包括在固相支持物上包被抗原进行生物淘选，使用免疫亲和层析注或BIAcore传感芯片，用生物素化抗原选择E37J，多肽E383，在固定的原核生物E393或哺乳动物E403细胞、组织培养细胞E41-4...
1．按每孔100pl蛋白抗原包被微量滴定板，4℃过夜。PBS中10ug／m1的浓度是包被抗原的标准浓度。但有时需要更高的浓度或者不同的包被缓冲液（比如碳酸盐缓冲液）。2．弃去抗原液并用PBS洗涤板孔2次。3．加入200gl的2％MPBS封闭每个板孔，37℃孵育2小时。4．用PBS洗涤板孔3次。5．每孔加入50ul的4％MPBS。6．每孔加入50ul含可溶性抗体的培养基上清，用移液器反复吹吸混匀，室温孵育1小时。7．弃去溶液，用PBS／Tween洗涤板孔3次，再用PBS洗涤3次...
噬菌体展示可使抗体亲和力提高到1000倍以上。很典型的起始点是自噬菌体抗体文库中分离特异性抗体。为完成亲和力的成熟（亲和力的增加），要对抗体序列进行多样化；突变基因文库展示在丝状噬菌体表面上，并在抗原上选择具有更高亲和力的结合性抗体。尽管整个过程已相当清晰，但研究者在进行体外亲和力成熟前必须明确：提高特定抗体亲和力将会产生预期的生物学效果。当尝试用抗体中和循环中的毒素或生长因子时，更高的亲和力就显得特别重要。在此情况下，抗体与抗原都分布于同样的区域，能使抗原抗体的相互作用达到...
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