利用血清筛选噬菌体文库

利用含有目标受体的复杂混合物，对噬菌体展示肽文库进行筛选。这适用于许多令人感兴趣的生物体系，如血清、脑脊液及其他生物性体液和细胞或组织表面等。在此情况下，目标就是要鉴定出结合于特定受体分子或结合于一组具有特定性质的受体上的多肽。我们及他人都在致力于鉴定那些可与疾病特异性相关的抗体（疾病特异性抗体，DS-Ab）相结合的多肽。这里我们所描述的方法，是用来鉴定丙型肝炎感染（HCV）特异性相关抗体的相应配体。HCV是一种性慢性肝病的主要病因。利用来自HCV感染者和非感染者的血清（以下...

荧光标记多肽的生物分布

实验过程的zui后步骤是以合成每一个结合性或定位性的多肽来作为荧光标记多肽[典型的荧光素或若丹明（rhodamine）]，然后在静脉注射后测定其生物分布的。荧光标记也使得多肽能在随后的没有任何修饰的受体分离中被使用：可以使用荧光多肽在基于细胞的表达性克隆系统中分类受体阳性的细胞，并且也可以通过高亲和性的鼠抗荧光素单抗体的使用把荧光多肽直接固定到固体基质上。在有偶合剂（couplingreagent）HATU（Sigma）和DMF（Sigma）的情况下，加入异硫氰酸荧光素I（f...

AP融合蛋白的亚克隆和表达

1．使用来自筛选出的噬菌粒克隆的模版DNA，以及包含与AP融合表达载体的克隆位点相对应的限制性酶切位点的寡核苷酸引物，进行PCR反应。2．通过琼脂糖凝胶电泳检测正确大小的扩增产物。选择相应方法对PCR产物进行纯化。3．用对应于克隆位点的限制性内切酶消化PCR产物，使用标准的方法将此产物连接到相同酶切后的AP融合蛋白表达载体中。4，通过标准的方法将连接产物转化入大肠杆菌中，铺到含100ug/ml氨苄青霉素的LB平板上。挑取单克隆，利用标准的方法（如限制性酶切或PCR）鉴定是否有...

转移到麦芽糖结合蛋白中分析

麦芽糖结合蛋白ELISA的方法与以前论文所述一致[1Sj，除了从大肠杆菌中释放MBP—肽融合蛋白的裂解方法之外。我们发现，使用商业性的去垢剂（Pierce公司的B-PER抽提试剂）较溶菌酶能更简单有效地裂解细菌细胞。3ml培养基中的经诱导的细胞先通过沉降，再通过含有0．1mmol/LEDTA的lmlB-PER重悬。于室温下放置20分钟后，离心5分钟以除去细胞碎片，将上清转移到一个新的管中。裂解物于一70~0冻存，当用于ELISA反应时按1：50稀释。在几个实验项目中，我们发现...

噬菌体DNA/RNA结合性筛选的标准程序

1．合成需要的靶标DNA或RNA寡核苷酸，其中一组是5’端连接生物素的寡核苷酸链。为dsDNA位点合成一条不联结生物素的互补副链。2．①对于DNA位点的筛选，将每条寡核苷酸链各取10u1，与20/A1的2X核酸退火缓冲液混匀，让两条互补的寡核苷酸退火。在PCR仪中以94℃加热样品3分钟，然后以每分钟2℃的速度冷却至4℃。冷却后，用水将溶液稀释至1pmol/L的终浓度，于-20℃保存。②对于RNA位点筛选，用RNA折叠缓冲液（1XCM）配制1pm01/L的寡核苷酸溶液。将溶液加...

借助于噬菌体ELISA的DNA/RNA结合活性的分析方法

A.噬菌体的制备1．挑取含有源自文库筛选的噬菌体克隆的单菌落。用灭菌牙签挑取单菌落接种于灭菌圆底培养板的微孔内，其中加有150ul含15ug/ml的四环素的2×TY培养基。用一个微孔培养展示野生型DNA/RNA结合区域的噬菌体，作为阳性对照。以250r/min的速度小心振荡微孔板，30℃培养16小时。2．在合适的吊斗式离心机中3700g离心96孔培养板15分钟，以制备噬菌体上清液。将上清液转移到一个新的微孔板内，4℃保存。B.噬菌体ELISA1，将生物素联结的核酸靶标位点（通...

蛋白质PYR1调节植物抗旱机制

植物体内的一种激素脱落酸可帮助植物对抗干旱等恶劣生存条件，但科学界对这类植物激素的具体作用机制却知之甚少。西班牙等国研究人员日前发现脱落酸帮助植物抗旱的具体机制，为有效提高植物抗旱能力开辟了新思路。此前研究曾发现，在正常环境下，植物体内一种名为PP2C的蛋白质会阻止脱落酸发挥作用，当植物处于极度干旱条件下时，这种阻断作用就会消失，植物细胞中脱落酸的含量上升，从而帮助植物抗旱。研究同时认为，PP2C蛋白质并不会直接作用于脱落酸，而是通过另外一群蛋白质间接发挥作用。这些“中介蛋白...

中国体外诊断产业发展历史

体外诊断产业是医疗器械及医药工业的一个组成部分，中国体外诊断产业是个新兴产业，共有20二十年左右的发展历史，是一个自发形成和成长起来的产行业。体外诊断是指将样本（血液、体液、组织等）从人体中取出后进行检测进而进行诊断，是相对于体内诊断而言。检测过程中需要相应的仪器和试剂，而这些仪器和试剂就组成了体外诊断系统，从事这些仪器和试剂研发、生产和营销的企业就形成了体外诊断产行业，它汇集了生物、医学、电子、机械等相关技术。体外诊断产品按检验医学的检测项目可分为几个主要大类：生化、免疫、...