从预制的入GTll文库中制备cDNA插入片段

[方法]A.PCR扩增cDNA插入片段1．在冰浴中将以下成分加到0．2m1微量离心管中（执行10步反应）●水，36．5ul●10×Pfu缓冲液，5．0ul●10mmol/LdNTP，1．5ul●λGTll正向引物（10umol/L），2．5ul●λGTll反向引物（10umol/L），2．5ul●已制备好的Sfi-NotIλGTllcDNA文库，1．Oul●PfuDNA聚合酶（2．5U/ul），1．0ul2．混合反应物并用50ul的矿物油覆盖。3．在95℃下使模板变性2分钟，...

从外周血淋巴细胞（PBls）中分离RNA

[方法]1．收集新鲜人血液并立即用Ficoll分离白细胞。2．用冰冷PBS洗涤外周血淋巴细胞3次。3．在50ml塑料离心管中收集外周血淋巴细胞，并加入7ml裂解缓冲液（可溶解达到5×108个外周血淋巴细胞），然后剧烈涡旋振荡以溶解细胞。4．加入7体积（49m1）4m01/L氯化锂，4℃孵育15～20小时（过夜）。5．将悬液转移到30mlCorex管内，在吊桶式转头内4℃离心2小时，6500r/min。6．弃去上清，并用Kimwipe擦拭试管口。用3mol/L氯化锂（大约15m...

cDNA*链的合成

[方法]1．为合成cDNA*链，在1个1．5ml硅化微量离心管中制备以下反应混合液，●10－RT缓冲液，5ul●20×dNTP，5ul●100mmol/LDTT，5ul●HuIgMFOR引物，2ul●HuCκFOR引物，2ul●HuCλFOR引物，2ul●RNAsin，80U（2ul）●所有引物浓度均为10pmol/ul2．取整数体积（1～4ug）存于乙醇中的RNA，放在1个无菌1．5ml微量离心管内，并用微型离心机离心5分钟。用70%乙醇洗涤沉淀1次，晾干，并用24．5ul...

scFv和载体DNA的连接

[器材和试剂]●T4DNA连接酶及10×缓冲液（NEB）●酚/氯仿（Sigma）●100%和70%乙醇，-20℃保存●消化的载体和scFv文库●TE（10mmol/LTrispH8，lmmol/LEDTA）[方法]1.如下所述，配制两个100ul连接混合液，其中1个用于VH-VκscFv文库，另1个用于Vu-VλscFv文库，并设置两个对照反应。对照可以确定未切的载体有多少（对照2），以及确定无插入序列时有多少重新连接的载体（对照1）。要保持恰当的比例，所获得的克隆数（对于相...

电感受态大肠杆菌TGl的制备

[方法]1．将大肠杆菌TG1种到基本培养琼脂板，37℃过夜。2．将基本培养琼脂板上的大肠杆菌TGl再接种到含有15m12XTY培养基的100ml形瓶中。37℃振荡培养过夜。3．用5ml夜培养的TGl接种到两个含500m12×Y培养基的2L有挡板锥形瓶中。在摇床中培养约1．5小时，直到A600接近0．5。4．将菌液转移4个预冷离心瓶中（约250ml/瓶）。平衡后，置于冰上20分钟。5．以3000g，4℃离心15分钟。使用前预冷所有转头。6，弃去上清，并以起始体积的冰冷lmmol...

在微量滴定板中表达可溶性scFv

[器材和试剂]●用于细菌培养的96孔圆底微量滴定板（Nunc，目录号62162）●含100ug/ml氨苄青霉素和0．1％葡萄糖的2XTY培养基（2×TY/amp/0．1％glu）●含100ug/ml氨苄青霉素和3mmol/LIPTG的2XTY培养基（2×TY/amp/glu/IPTG）（参见实验方案13．10）●噬菌体样品[方法]1．用96孔无菌转移设备或移液器从主板中，每孔取2ul；而后转移至1个每孔含有100ul2×TY/amp/0.1％glu的无菌96孔微量滴定板中。2...

用PCR识别不同的噬菌体抗体克隆

[方法]1．配制PCR“主混合液”，每克隆20ulPCR混合液，包含：●水，15．5ul●10XRT缓冲液，2．0ul●5mmol／LdNTP，1．0ul●5，引物，1．0ul●3，引物，1．0ul●Taq聚合酶，0.2ul如果PCR缓冲液中不含Mg2+，这应加至终浓度为1．5mmol／L。也可以使用与DNA聚合酶配套供应的PCR试剂。2．取20fLl主混合液加到0．5m1管内，或加入96孔PCR微孔板孔内。3．用l根牙签轻轻接触单个克隆并在PCR反应液中转动，注意不要转移太...

再扩增SCFvVLCDR3基因文库

[器材和试剂]●PCR试剂和设备●WinardPCR纯化试剂盒（Promega）●定制的DNA引物●VL—NotI引物（5，—GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGCACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAACACCCAACC—3’）●LMB3引物●用于scFv基因文库限制性消化的试剂和设备●已扩增的scFv基因文库DNA[方法]1．配制4个50ulPCR反应混合液，包含：●去离子水，35．5ul●20×dNTP（每种5mmol/L），2．5u...