连接scFv和载体DNA并转化大肠杆菌

[器材和试剂]●去离子水（millipore）●T4DNA连接酶和10×连接酶缓冲液（NEB）●16℃水浴●消化的scFv文库DNA●pHENlDNA，用NcoI和NotI消化（100ng／ul）●电感受态大肠杆菌TGl细胞（Strataeene）●用于将scFv文库电转化到大肠杆菌TGl株的试剂和设备[方法]1．配制1个50ul连接混合液，包含：●10×连接缓冲液，5uI●水，16ul●NcoI和NotI消化的pHENl（100g／ul），20ul●VcoI和NotI消化的...

平衡法选择高亲和力噬菌体抗体

1．多样化的噬菌体抗体丈库中制备噬菌体抗体。2．根据厂家说明，对抗原进行生物素化。3．选择前，在1个1．5m1微量离心管中．用2％MPBS1m1封闭150ul链霉亲和素磁珠，室温1小时。用磁性试管架将碰珠吸向一侧。弃去缓冲液。4．用2％MPBS封闭3个1．5m1微量离心管，室温1小时；而后，弃去封闭缓冲液。以3个不同浓度将士物素化抗原（总共3管）与溶于2％MPDS（终浓度）的1m1噬茼体样品（大约1012c{u／m1）进行孵育，室温振荡l小时。对于*轮选择，抗原浓度应分别为K...

用Biacore仪筛选解离速率较低的scFv

选择3～5轮后，随机挑取克隆加入96孔微量滴定板中并诱导表达可溶性scFv。然后，在包被有相关抗原的96孔微量滴定板中，用ELISA分析含有可溶性scFv的细菌上清。此过程可以识别出那些结合了抗原的scFv。但即便采用上述严谨性选择后，ELISA阳性克隆中仅有部分克隆的亲和力比野生型高。ELISA信号强度不能很好地显示哪个克隆具有较低的Ka值，而且更为普遍的是它与scFv表达水平相关。因此，这就需要一种筛选ELISA阳性克隆的技术，能识别出具有较低Ka值的克隆。竞争性或抑制性...

鞣酸—柠檬酸钠还原法制备胶体金分散颗粒

A液（80ml）：1％氯化金，lml；双重蒸馏水，79ml。B液（20m1）：1％柠檬酸钠，4ml；1％单宁酸，0.lml；双重蒸馏水，15．8ml。25mmol/LK2C03，0．1ml；将上述A液加热到60℃，然后将B液快速加入到A液中，继续搅拌，在极短的时间内加热到煮沸（大约10min），此时颜色由黑一蓝一亮红（近似红葡萄酒颜色）变化。pH调到所需要求（根据所标记蛋白质种类的不同，所需的pH也不一样）。上述用量合成的胶体金为10nm，根据所加入鞣酸（或称单宁酸）量的不同...

制备胶体金分散颗粒的其他方法

乙醇—超声波还原法（Baigent和Muller，1980）（1）取1％AuCl3·HCl水溶液lml加入100ml双重蒸馏水。（2）用0．2m01/LK2C03调pH至7．2，再加入lml无水乙醇。（3）用20KC、135W超声波探头浸入溶液内进行超声振荡，此法制备的颗粒为6～10nm。硼氢化钠还原法（Tschopp等，1982）（1）取0．6ml1％氯化金水溶液，加入40ml预冷（4℃）双蒸馏水。（2）再加入0．2mol/LK2C030．2ml。（3）边搅拌边加入新鲜配制...

生物实验室安全

『安全』是进行任何实验zui重要的考量，若不留意，经常会造成*的遗憾，因此，请遵守以下各项规定：1.请事先勘查紧急冲洗站、洗眼台及灭火器的位置。2.请避免穿着凉鞋或拖鞋（脚趾不要裸露），并请穿着实验衣。留长发者，在实验进行前将头发束好。3.在实验室请勿吸烟、化妆、嚼口香糖、吃东西、喝饮料。食物不可存放于实验室的冰箱中。4.实验前后请将工作区域清理擦拭干净，实验中打翻任何药品试剂时，要随时清理；离开实验室前请记得洗手。5.使用刻度吸管时，切勿用嘴吸取，请用安全吸球或吸管唧筒。6...

微量移液器之拆解与组装方法步骤

微量移液器（micropipet）是进行生化实验或分子生物学实验的*工具，然而使用方法的正确与否，以及微量移液器的准确性，都直接影响了实验结果的正确性，故请对你持有之微量移液器作深入的认识。本实验室所使用的微量移液器为GilsonPipetmanP系列，包括P1000,P200,P20等。以下使用方法及注意事项，部份取材自原厂所附說明书，请详读之后才进行实验。1）请参照图1.1，认识微量移液器每一部份组件之位置及名称。2）将D（ejector）取下，C（connectingn...

琼脂糖胶体电泳 （agarose gel electrophoresis）

仪器用具：迷你电泳槽及铸胶器（MupidII）；UVtransilluminator及影像分析系统；防护面罩药品试剂：琼脂糖粉末（agarose,lowEEO）1×TAE电泳缓冲液（40mMTris-acetate,1mMEDTA,pH8.0）：由50×TAE（每1L含242gTrisbase,57.1mLglacialaceticacid,100mL的0.5MEDTA-8.0）稀释使用。10×追踪染剂（0.25%bromophenolblue,0.25%xylenecyan...