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仪器用具：37℃及65℃水浴或恒温槽药品试剂：质体pBluescriptIISK（-）限制酶：BamHI,PvuII及ScaI（浓度均为10units/μL,Invitrogen）10×Reactionbuffer6（0.5MTris-HCl,pH7.4;60mMMgCl2;0.5MNaCl;0.5MKCl）无菌水方法步骤：1）取7支微量离心管，依下表所列体积（单位μL）依序加于管壁不同位置上。◆每次吸取限制酶时，请换一支新的微量移液器头以免造成污染。总体积为20μL，短暂离...
方法步骤：1）前一天转形的培养皿，当菌落长至约0.5mm大小时，将培养皿移至4℃放置1h。2）准备一张无菌的硝化纤维滤膜，以铅笔在边缘标上组别。◆请戴手套后再拿取滤膜！3）打开培养皿盖子，以两支扁平镊子将滤膜两边夹住，轻轻覆盖在菌落上方，尽可能避免有气泡产生。◆注意！滤膜覆盖上去后就不要再移动！4）等滤膜*湿透后，以针头在滤膜边缘戳洞做记号（至少做三个记号）。小心把滤膜掀起，菌落朝上放置在LB/Amp/IPTGplate上。盖上盖子，在37℃培养2~4h，以诱导启动T5pro...
仪器用具：平端镊子药品试剂：Nitrocellulose滤膜LB/Amp/IPTG/X-Glucplate（LBplate添加100μg/mLampicillin,0.2MIPTG,50μg/mLX-Gluc）方法步骤：1）前一天进行转形的培养皿，当菌落长至约0.5mm大小时，将培养皿移至4℃放置至少1h。2）准备一张无菌的硝化纤维滤膜，以铅笔在边缘标上组别。◆请戴手套后再拿取滤膜！3）打开培养皿盖子，以两支扁平镊子将滤膜两边夹住，轻轻覆盖在菌落上方，尽可能避免有气泡产生。◆...
方法步骤：1）吸取20μL的蛋白质样本，小心注入微量滴定盘中，避免气泡产生。2）每一样品槽加入200μL基质液，混合均匀；可用烧热的接种环去除气泡。3）静置约1~2min，颜色开始加深，然后加入30μL终止液。反应时间的长短，要以样本中的酶活性大小來做调整。因为我们只测定色析法各分划的相对酶活性，因此并不加终止液。4）以ELISA光度计测定波长415nm的吸光值。酶活性单位的测定：a.以上步骤，只可测定GUS活性的相对大小，对色析法所得到的各个分划进行侦测，相当方便，但并非酶...
方法步骤：1）尿素洗过夜的转印纸再以10mLPBST洗三次，每次约10min，均在上述方形培养皿中进行。2）转印纸放在明胶NET溶液中反应，置室温中反应1h。一般使用方形培养皿当容器，但亦可装入塑料袋中反应，较节省试剂用量。3）反应后，以PBST浸洗二次。4）把转印纸放在抗体溶液中反应，置室温反应1h。5）反应后以PBST洗三次，改用酶联体反应，在室温下反应1h。6）以PBST洗四至五次，注意容器也要洗干净。7）加入DAB基质溶液约10mL呈色，尽量避光，并且不时摇动呈色液。...
[方法]1．配制4个50ulPCR反应混合液，包含：●去离子水，35．5ul●20×dNTP（每种5mmol/L），2．5ul●10×Vent聚合酶缓冲液，5．0ul●LMB3引物（10pmol/ul），2．5ul●VL—NotI引物（10pmol/ul），2．5ul●scFV基因模板DNA（100ng），1ul●VentDNA聚合酶（2单位），1．0ul2．在有加热盖的热循环仪内，加热反应混合液到94℃5分钟。3．以94℃1分钟、42℃1分钟、72℃2分钟的条件共循环30次...
[方法]1．配制1个50ul连接混合液，包含：●10×连接缓冲液，5uI●水，16ul●NcoI和NotI消化的pHENl（100g／ul），20ul●VcoI和NotI消化的scFv文库（100g/ul）,7ul●T4DNA连接酶（400U／ul），2ul2．16℃孵育反应液过夜。3．乙醇沉淀DNA并用70％乙醇洗涤沉淀1次。4．重悬DNA于10ul水中。5．用4份相同的2．5ul的DNA分别电转化到电感受态大肠杆菌TGl细胞中。6．确定文库容量，并将菌文库材抖储存于-70...
[方法]1．每个克隆用lml2XTY／amp／S1u30~C培养过夜，250r／min振荡。2．取50u1过夜培养物，加入到含有5ml2XTY／amp／0．1％glu的50ml试管内；并在30℃培养大约2小时，250r／Illin振荡，吸光度（A600）大约0．9。3．每管加入2．5ullmol／LIPTG诱导scFv表达（终浓度为500umol／L），并在30℃培养4h，250r／min振荡。在1个15mlFalcon试管内4000g离心15分钟，收集细胞。4．准备外周质提...
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